Microscopia cu fluorescență este o tehnică puternică care permite cercetătorilor să vizualizeze molecule și structuri specifice din celule și țesuturi. Pentru a pregăti probe pentru microscopia cu fluorescență, un microtom cu criostat este adesea folosit pentru a tăia secțiuni subțiri de țesut înghețat. În această postare pe blog, voi împărtăși câteva informații despre cum să utilizați un microtom cu criostat pentru microscopia cu fluorescență, bazându-mă pe experiența mea ca furnizor de microtom cu criostat.
Înțelegerea microtomului criostat
Un microtom criostat este un instrument specializat conceput pentru a tăia secțiuni subțiri de țesut înghețat la temperaturi scăzute. Este alcătuit dintr-o lamă de tăiere, un suport pentru specimen și o cameră cu temperatură controlată. Temperatura scăzută ajută la păstrarea structurii țesuturilor și la prevenirea degradarii moleculelor fluorescente.
Există diferite tipuri de microtome criostat disponibile pe piață. De exemplu, celCriotomoferă capabilități de tăiere precise, în timp ceCriostate semi-automateoferă un echilibru bun între automatizare și controlul utilizatorului. NoastreMicrotom criostatcombină funcții avansate pentru a răspunde nevoilor diverse ale cercetătorilor.
Pregătirea microtomului criostat
Înainte de a utiliza microtomul criostat, este esențial să pregătiți instrumentul în mod corespunzător. Mai întâi, curățați lama de tăiere și suportul pentru specimen pentru a îndepărta orice resturi sau contaminanți. Utilizați o soluție de curățare adecvată și o perie moale pentru a asigura o curățare temeinică.
Apoi, setați temperatura camerei criostatului. Temperatura ideală depinde de tipul de țesut secționat. În general, o temperatură între -18°C și -25°C este potrivită pentru majoritatea țesuturilor. Lăsați criostatul să atingă temperatura setată înainte de a continua.
Pregătirea probei de țesut
Calitatea pregătirii probei de țesut este crucială pentru microscopia cu fluorescență de succes. Începeți prin a fixa țesutul într-un fixativ adecvat. Pentru microscopia cu fluorescență, fixative precum paraformaldehida sunt utilizate în mod obișnuit, deoarece păstrează bine semnalele fluorescente.
După fixare, țesutul trebuie crioprotejat. Aceasta implică scufundarea țesutului într-o soluție crioprotectoare, cum ar fi zaharoza, pentru a preveni formarea de cristale de gheață în timpul înghețului. Țesutul este apoi congelat într-un mediu de congelare adecvat, cum ar fi compusul OCT.
Montarea țesutului pe suportul pentru specimen
Odată ce țesutul este înghețat, acesta trebuie montat pe suportul pentru specimen. Așezați cu grijă blocul de țesut congelat pe suportul pentru specimen și fixați-l folosind dispozitivul de montare corespunzător. Asigurați-vă că țesutul este centrat și ferm atașat de suport pentru a asigura o secționare precisă.
Setarea parametrilor de secţionare
Înainte de a începe procesul de secționare, setați parametrii de secționare pe microtomul criostat. Acești parametri includ grosimea secțiunii, viteza de tăiere și rata de avans. Grosimea secțiunii depinde de tipul de țesut și de cerințele experimentului de microscopie cu fluorescență. Pentru majoritatea aplicațiilor, este potrivită o grosime a secțiunii de 5 - 10 micrometri.
Viteza de tăiere și viteza de avans trebuie ajustate în funcție de duritatea țesutului. Țesuturile mai moi pot necesita o viteză de tăiere mai mică și o rată de avans mai mică, în timp ce țesuturile mai dure pot tolera o viteză de tăiere mai mare.
Secționarea țesutului
Odată setați parametrii, începeți procesul de secționare. Avansați încet suportul pentru specimen spre lama de tăiere. Pe măsură ce lama taie prin țesut, vor fi produse secțiuni subțiri. Utilizați o perie fină sau un dispozitiv de ridicare a secțiunilor pentru a transfera cu atenție secțiunile pe o lamă de sticlă.
Este important să manipulați secțiunile cu grijă pentru a evita deteriorarea. Asigurați-vă că secțiunile sunt distribuite uniform pe diapozitiv și nu se suprapun.
Colorarea fluorescentă a secțiunilor
După secționare, următorul pas este colorarea secțiunilor cu coloranți fluorescenți. Există diferiți coloranți fluorescenți disponibili pentru diferite aplicații, cum ar fi DAPI pentru colorarea nucleară și coloranții Alexa Fluor pentru etichetarea specifică a proteinelor.
Pregătiți soluția de colorare conform instrucțiunilor producătorului. Incubați secțiunile în soluția de colorare pentru timpul potrivit. După colorare, spălați bine secțiunile pentru a îndepărta orice exces de vopsea.
Montarea secțiunilor colorate
Odată ce secțiunile sunt pătate, acestea trebuie să fie montate pe o lamelă. Utilizați un mediu de montare adecvat care este compatibil cu coloranții fluorescenți. Puneți o picătură de mediu de montare pe secțiunile pătate și coborâți cu atenție lamela pe lame, evitând formarea bulelor de aer.
Imaginirea secțiunilor
În cele din urmă, secțiunile colorate sunt gata pentru microscopia cu fluorescență. Așezați lama pe platoul microscopului și reglați focalizarea și mărirea pentru a vizualiza semnalele fluorescente. Utilizați filtrele adecvate pentru a detecta diferiții coloranți fluorescenți.
Depanare și sfaturi
- Sectiunea Calitate: Dacă secțiunile sunt încrețite sau rupte, verificați dacă lama de tăiere este tocită sau deteriorată. O lamă ascuțită este esențială pentru producerea secțiunilor de înaltă calitate.
- Semnal fluorescent: Dacă semnalul fluorescent este slab, verificați protocolul de colorare. Asigurați-vă că timpul de colorare și concentrația de colorant sunt adecvate. De asemenea, asigurați-vă că secțiunile nu sunt spălate excesiv, deoarece acest lucru poate reduce semnalul fluorescent.
- Controlul temperaturii: Mențineți o temperatură stabilă în camera criostatului pe tot parcursul procesului de secționare. Fluctuațiile de temperatură pot afecta calitatea secțiunilor.
Contact pentru achizitie si consultanta
Dacă sunteți interesat să achiziționați un microtom cu criostat pentru nevoile dvs. de microscopie cu fluorescență sau dacă aveți întrebări cu privire la utilizarea acestuia, nu ezitați să ne contactați. Echipa noastră de experți este pregătită să vă ajute în găsirea instrumentului potrivit pentru cercetarea dumneavoastră.
Referințe
- Histologie: un text și atlas de Michael H. Ross și Wojciech Pawlina.
- Microscopie cu fluorescență: principii, tehnici și aplicații de Richard P. Haugland.